七种香豆素类化合物对大鼠肝微粒体CYP3A4活性的影响

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目的以咪达唑仑为探针底物,通过体外肝微粒体培育体系,观察六种呋喃香豆素类化合物(补骨脂素、花椒毒酚、花椒毒素、异回芹素、欧前胡素、异欧前胡素)及一种简单香豆素即蛇床子素对大鼠肝微粒体细胞色素P4503A4(Cytochrome P4503A4)活性的影响,计算半数抑制浓度IC50,并比较七种化合物作用的强弱。在体外代谢实验结果的基础上,观察给予白芷总香豆素组分(TCD)对经CYP3A4代谢的药物硝苯地平在大鼠体内药动学参数的影响。方法第一,用4只成年雄性Wistar大鼠,经苯巴比妥诱导,利用钙离子沉淀法制备大鼠肝微粒体,并测定大鼠肝微粒体总蛋白含量、CYP总量和细胞色素b5(cytb5)。第二,500μL体外温孵培育体系中,各加入六种6,7-呋喃香豆素类化合物及一种简单香豆素即蛇床子素或阳性对照药氯霉素,浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0μmol·mL-1,并且建立空白对照组;每管加入CYP3A4的探针药咪达唑仑(Midazolam,MDZ)后,于37℃振摇水浴中先预孵5min后再孵育15min,冰浴中冷却结束反应。用液相色谱法测定体外温孵反应体系中探针药代谢物1’-羟基咪达唑仑(1-OH-MDZ)的终浓度,重复实验操作5次并计算IC50,评价这七种香豆素类化合物对大鼠肝微粒体CYP3A4活性的影响。第三,将30只雄性Wistar大鼠,按体重随机分成3组,白芷总香豆素组分别经灌胃给予总香豆素25、50mg/kg,每日一次,连续3日。第三次灌胃1小时后,各组灌胃硝苯地平10mg/(2.5mL·kg-1),于硝苯地平灌胃结束开始计时,5、15、30min和1、1.5、2、3、4、5、6、8h,由尾部取血0.5mL,血样置于肝素化的塑料管中,4000r min-1离心15min,分离出血浆,以非那西丁为内标,用HPLC法测定不同时间点的硝苯地平血浆浓度,根据测定样品数据计算大鼠体内硝苯地平的药代动力学参数。结果1.经苯巴比妥诱导的大鼠肝微粒体CYP总量为0.55nmol·mg-1Protein,蛋白含量为20.64mg·g-1Live wet,cytb5含量为0.38nmol·mg-1Protein。苯巴比妥诱导的大鼠肝微粒体蛋白量比空白增加了22.4%。2.对CYP3A4的IC50值(μmol·L-1)分别为补骨脂素(6.74)、花椒毒酚(7.45)、欧前胡素(9.63)、异欧前胡素(16.48)花椒毒素(67.34)异回芹素(75.69)、蛇床子素(89.56)、氯霉素(0.64)。七种香豆素化合物对CYP3A4抑制程度不一,呈剂量依赖性抑制(P<0.01)。3.三组硝苯地平主要药动学参数:对照组Ka(0.26h-1)、Ke(0.15h-1)、t1/2α(0.93h)、 t1/2β(2.42h)、 Cmax(114.24μg L-1)、Tmax(1.52h)、 Vd(1.32L·kg-1)、CL(0.24L h-1)、AUC(868.44μg h L-1);低剂量组Ka(0.32h-1)、Ke(0.09h-1)、t1/2α(1.29h)、 t1/2β(2.85h)、 Cmax(132.48μg L-1)、Tmax(1.83h)、 Vd(1.35L·kg-1)、CL(0.19L h-1)、AUC(1127.61μg h L-1);高剂量组Ka(0.37h-1)、Ke(0.04h-1)、t1/2α(1.85h)、 t1/2β(3.65h)、 Cmax(149.75μg L-1)、Tmax(2.04h)、 Vd(1.41L·kg-1)、CL(0.16L h-1)、AUC(1481.69μg h L-1)。在给予白芷总香豆素的两组中,硝苯地平血药峰浓度,浓度曲线下面积明显比单独用药组高,表明白芷总香豆素组分对硝苯地平血药浓度有显著影响,并且呈剂量依赖性。消除速率常数Ke和清除率CL与对照组相比也有显著降低(P<0.05)。结论1、经苯巴比妥诱导后,利用CaCl2沉淀法制备大鼠肝微粒体CYP总量显著提高,能充分满足体外药物代谢研究的需要。2、补骨脂素、花椒毒酚和欧前胡素对大鼠肝微粒体CYP3A4的活性呈中等程度的抑制作用,其他香豆素类化合物抑制作用不明显,IC50<100μmol·L-1。对CYP3A4抑制程度是:补骨脂素≥花椒毒酚>欧前胡素>异欧前胡素>花椒毒酚>异茴芹素>蛇床子素。3、在大鼠体内白芷总香豆素组分可抑制硝苯地平的代谢,改变硝苯地平的药代动力学参数,使K降低,t1/2延长,AUC增大,CL下降。
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